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產(chǎn)品詳情
蛋白樣品制備
1.單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提取
（1） 倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫菏箽堄嗯囵B(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。
（2） 每瓶細(xì)胞加3 ml 4℃預(yù)冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放輕輕搖動1 min洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。
（3）按1ml裂解液加10 ul PMSF（100 mM），搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合。）
（4） 每瓶細(xì)胞加400 ul含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動。
（5）裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動作要快），然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5 ml離心管中。（整個(gè)操作盡量在冰上進(jìn)行。）
（6）于4℃下12000 rpm離心5 min。（提前開離心機(jī)預(yù)冷）
（7） 將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5 ml的離心管中放于－20℃保存。
2.組織中總蛋白的提取
（1）將少量組織塊置于1～2 ml勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。
（2） 加400 uL單去污劑裂解液裂（含PMSF）于勻漿器中，進(jìn)行勻漿。然后置于冰上。
（3）幾分鐘后再碾一會兒再置于冰上，要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。
（4） 裂解30 min后，即可用移液器將裂解液移至1.5 ml離心管中，然后在4℃下12000 rpm離心5 min，取上清分裝于0.5 ml離心管中并置于－20℃保存。
3.加藥物處理的貼壁細(xì)胞總蛋白的提取
由于受藥物的影響，一些細(xì)胞脫落下來，所以除按1操作外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細(xì)胞。以下是培養(yǎng)液中細(xì)胞總蛋白的提取：
（1）將培養(yǎng)液倒至15 ml離心管中，于2500 rpm離心5 min。
（2）棄上清，加入4 ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌，然后2500 rpm離心5 min。棄上清后用PBS重復(fù)洗滌一次。
（3）用槍洗干上清后，加100 uL裂解液（含PMSF）冰上裂解30 min，裂解過程中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解。
（4）將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4℃、12000 rpm離心5 min，取上清分裝于0.5 ml離心管中并置于－20℃保存。
