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PCR反應中有兩條引物，即5′端引物和3′引物。設計引物時以一條DNA單鏈為基準（常以信息鏈為基準），5′端引物與位于待擴增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物與位于待擴增片段3′端的一小段DNA序列互補。
1. 引物設計的基本原則
（1） 引物長度：15-30 bp，常用為20 bp左右。
（2） 引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
（3） 引物內部不應出現互補序列。
1. 引物設計的基本原則
（1） 引物長度：15-30 bp，常用為20 bp左右。
（2） 引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
（3） 引物內部不應出現互補序列。
（4）兩個引物之間不應存在互補序列，尤其是避免3 ′端的互補重疊。
（5） 引物與非特異擴增區的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續8個堿基在待擴增區以外不能有完全互補序列，否則易導致非特異性擴增。
（6）引物3‘端的堿基，特別是最末及倒數第二個堿基，應嚴格要求配對，最佳選擇是G和C。
（7） 引物的5 ′端可以修飾。如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素、熒光物質、地高辛標記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。
2. 引物設計軟件
Primer Premier5.0 （自動搜索）*、Oligo6 （引物評價）、Vector NTI Suit、DNAsis、Omiga、DNAstar、Primer3 （在線服務）。
