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產品詳情
一、標準的PCR反應體系
10×擴增緩沖液 10 ul
4種dNTP混合物 各200 umol/L
引物 各10～100 pmol
模板DNA 0.1～2 ug
Taq DNA聚合酶 2.5 u
Mg2+ 1.5 mmol/L
加雙或三蒸水至 100 ul
二、PCR引物設計
1. 引物設計的基本原則
（1） 引物長度：15-30 bp，常用為20 bp左右。
（2） 引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
（3） 引物內部不應出現互補序列。
（7） 引物的5 ′端可以修飾。如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素、熒光物質、地高辛標記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。
2. 引物設計軟件
三、模板的制備
（1）PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。
（2）模板的取材主要依據PCR的擴增對象，可以是病原體標本如病毒、細菌、真菌等。也可以是病理生理標本如細胞、血液、羊水細胞等。法醫學標本有血斑、精斑、毛發等。（3）標本處理的基本要求是除去雜質，并部分純化標本中的核酸。多數樣品需要經過SDS和蛋白酶K處理。難以破碎的細菌，可用溶菌酶加EDTA處理。所得到的粗制DNA，經酚、氯仿抽提純化，再用乙醇沉淀后用作PCR反應模板。
四、PCR反應條件的控制
1. PCR反應的緩沖液提供合適的酸堿度與某些離子 。
2. 鎂離子濃度總量應比dNTPs的濃度高，常用1.5 mmol/L。
3. 底物濃度dNTP以等摩爾濃度配制，20～200 umol/L。
4. TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul）。
5. 引物 濃度一般為0.1 ～0.5 umol/L。
6. 反應溫度
（1）變性溫度和時間95℃，30 s。
（2）退火溫度和時間 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。
（3）延伸溫度和時間72℃，1 min/kb(10 kb內）。
（4）Tm值=4(G+C) +2(A+T)
五、PCR的循環參數
1. 預變性（Initial denaturation）
模板DNA完全變性與PCR酶的完全激活對PCR能否成功至關重要，建議加熱時間參考試劑說明書，一般未修飾的Taq酶激活時間為兩分鐘。
2. 循環中的變性步驟
循環中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列完全變性，可能的情況下可 縮短該步驟時間，變性時間過長損害酶活性，過短靶序列變性不徹底，易造成擴增失敗。
3. 引物退火（Primer annealing）
退火溫度需要從多方面去決定，一般根據引物的Tm值為參考，根據擴增的長度適當下調作為退火溫度。然后在此次實驗基礎上做出預估。退火溫度對PCR的特異性有較大影響。
4. 引物延伸
引物延伸一般在72℃進行（Taq酶最適溫度）。但在擴增長度較短且退火溫度較高時，本步驟可省略
延伸時間隨擴增片段長短而定，一般推薦在1000 bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設定為1 min/kbp
5. 循環數
大多數PCR含25-40循環，過多易產生非特異擴增。
6. 最后延伸
在最后一個循環后，反應在72℃維持5-15分鐘．使引物延伸完全，并使單鏈產物退火成雙鏈。
六、PCR步驟
1. DNA變性
（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下， 氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。
2. 退火
（25℃-65℃）：系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。
3. 延伸
（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。
七、PCR檢測
PCR反應擴增出了高的拷貝數，下一步檢測就成了關鍵。熒光素（溴化乙錠，EB）染色凝膠電泳是最常用的檢測手段。電泳法檢測特異性是不太高的，因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因為其簡捷易行，成為了主流檢測方法。近年來以熒光探針為代表的檢測方法，有逐漸取代電泳法的趨勢。
實驗流程及案例展示
