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焦磷酸測序（Pyrosequencing）
焦磷酸測序技術是由4種酶（DNA 聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase)、熒光素酶(luciferase)和三磷酸腺苷雙磷酸酶(Apyrase)）催化的同一反應體系中的酶級聯化學發光反應。
實驗方法
1.甲基化處理
使用Qiagen EpiTect Bisulfite Kit試劑盒
步驟一：亞硫酸鹽處理DNA
1.解凍DNA，Bisulfite Mix用800μl Rnase-Free水稀釋，旋渦震蕩，直到所有的Bisulfite Mix完全溶解（存放時間-20℃，4周）。如果需要可以加熱溶液到60℃，而后震蕩混勻；不要將已經溶解的Bisulfite Mix放在冰上。
2.用PCR管，準備經行亞硫酸鹽反應，將DNA用Rnase-free水定容至20μl。反應體系如下：
DNA： 20μl
Bisulfite Mix： 85μl
DNA Protect Buffer： 35μl
Total： 140μl
3.在常溫下，徹底混勻反應混合液，溶液會在DNA Protect Buffer加入后由綠色變成藍色。
4.使用PCR儀經行眼硫酸鹽反應（約5h）。反應程序如下：
95℃ 5min→60℃ 25min→95℃ 5min→60℃ 85min→95℃ 5min→60℃ 175min→20℃ Forever
步驟二：洗滌甲基化后DNA
1.使用掌上離心機離心PCR管，將反應后的溶液轉入新的1.5ml離心管中。
2.向1.5ml離心管中加560μl現配的含有10μg/ml carrier的Buffer BL。旋渦混勻混合液后，離心。
3.將EpiTect Spin Colums吸附柱放在收集管上，將上一步所有的混合液體倒入EpiTect Spin Colums吸附柱中，最高速離心1min（12000rpm 1min），倒掉廢液。
4.小心打開蓋子，加入500μl Buffer BW ，最高速離心1min（12000rpm 1min），倒掉廢液。
5.小心打開蓋子，加入500μl Buffer BD ，蓋上吸附柱蓋子，常溫放置15min，
（注意 ：勿將結晶倒入吸附柱；使用完BD后馬上蓋上蓋子，避免長期暴露在空氣中。）
6.最高速離心1min（12000rpm 1min），倒掉廢液。
7.小心打開蓋子，加入500μl Buffer BW ，最高速離心1min（12000rpm 1min），倒掉廢液。
8.重復上一步。
9.將吸附柱套在一個新的2ml收集管中，最高速空管離心1min（12000rpm 1min）。
10.將EpiTect Spin Colums吸附柱置于新的1.5mL離心管中，打開蓋子，56℃，孵育5min。
11.將EpiTect Spin Colums吸附柱置于新的1.5mL離心管中，在吸附柱中心加入20μl Buffer EB，15000×g 1min（12000rpm 1min）；再向吸附柱中加入20μl Buffer EB，15000×g 1min（12000rpm 1min）。
2.PCR
1引物設計： 所用軟件：PyroMark Assay Design 2.0（具體見Primer.xlsx）
2引物合成方法：由上海祥音生物科技合成
3 PCR用到的試劑：KAPA2G Fast Multiplex Mix （Code NO.：KM5802）。
4 PCR的操作步驟：
PCR擴增體系：
KAPA2G Fast Multiplex Mix 12.5μL
Forward primer (10 Μm) 1μL
Reverse primer (10 Μm) 1μL
Template DNA 1μL
ddH2O 9.5μL
Total 25μL
PCR擴增程序
94 ℃ 5 min
94 ℃ 30 sec
56 ℃ 30 sec
72 ℃ 1min
72℃ 5 min
12℃ forever
3.Pyrosequencing檢測
1. 在96孔PCR反應板中加入反應結合珠2 ul，結合緩沖液38ul，PCR產物40ul，室溫下充分混勻10min。
2. 開啟真空泵吸取結合珠及PCR產物混懸液，依次浸入70％ 乙醇，0.2M NaOH和沖洗緩沖液中各5 S;
3. 關閉真空泵,后將探頭上結合珠及PCR產物置人40ul退火緩沖液(含測序引物1．5 ul)，85℃變性2 min，冷卻至室溫,使引物與模板退火雜交。
4. 根據Pyrose quencing軟件序列設計信息所計算出劑量，在試劑艙中依次加入底物混合物、酶混合物及四種dNTP(QIAGEN)，
5. 將試劑艙及96孔反應板放入Pyrosequencing檢測儀(PyroMark Q96 ID，QIAGEN)進行反應，Pyro Q—CpG軟件自動分析每個位點甲基化狀態。
6. 樣品編號為原始編號。
