雙螢(熒)光素酶檢測服務

產品簡介

螢（熒）光素（Luciferase）是自然界中能夠產生生物發光的酶的統稱，其中最有代表性的是來自螢火蟲體內(Fire?y)和海腎(Renilla)體內的兩類螢光素酶，分別命名為F-Luciferase和R-Luciferase。在熒光素酶的催化下，熒光素底物可以高效的轉變成氧螢光素，同時發出強烈的光。

鑒于此，研究者利用熒光素酶開發出一套極其靈敏且使用方便的基因報告系統。目前這一系統被廣泛用于轉錄因子結合位點與啟動子活性分析、RNA降解、信號轉導、藥物篩選、動物活體成像等領域。

服務推薦

●　轉錄因子結合位點與啟動子活性分析

●　miRNA靶基因驗證

●　lncRNA吸附miRNA驗證

●　circRNA吸附miRNA驗證

●　專業的實驗方案設計

技術特點

●　強大的學術支持團隊協助設計科學合理的實驗方案

●　極簡的HB-infusion無縫克隆策略極大縮減載體構建周期

●　高效的LipoFiter轉染試劑和病毒轉導系統，確保結果穩定和可重復性

●　詳細的原始數據和實驗結果分析，確保結論清晰可靠

兩種常用載體類型極其應用場景

●　pGL3-Basic---用于轉錄因子結合位點與啟動子活性分析。把待分析啟動子區段構建到F-Luciferase上游，和轉錄因子共轉染分析F-Luciferase活性即可反應啟動子的活性高低。該質粒通常需要結合持續性表達R-Luciferase的載體作為內參以校正不同樣品之間轉染的轉染效率(參考案例一)。

●　psiCHECK2---miRNA與其靶點相關分析,包括miRNA靶基因驗證(參考案例二A和B)、lncRNA (參考案例三)與circRNA (參考案例四)吸附miRNA驗證等。需要把miRNA潛在結合靶點克隆到R-Luciferase (hRLuc) 3’UTR區域，然后與待測miRNA共同轉染細胞內測定R-Luciferase活性高低，F-Luciferase （hLuc+）作為校正內參校正不同樣品之間轉染的轉染效率。

技術路線

經典應用案例1

●　LncRNA轉錄因子結合位點與啟動子活性分析

論文來源: Wang, P., et al. (2014). "The STAT3-binding long noncoding RNA lnc-DC controls human dendritic cell differentiation." Science 344(6181): 310-313.

本文是曹雪濤實驗室在2014年發表在Science上一篇研究性論文。作者通過芯片鑒定出DC (樹突狀細胞)發育相關的一個lncRNA，命名為lnc-DC。同時高通量測序也發現了這條差異lncRNA的存在。進而作者通過Northern Blot驗證了這條lnc-DC。由于lnc-DC極其特異和穩定地高表達在DC發育過程的某一時期，所以作者假設lnc-DC可能是和表觀遺傳學調控事件相關的。為了驗證這一假設，作者通過染色體免疫沉淀結合測序的技術-CHIP-seq和qPCR發現lnc-DC的轉錄起始位點（TSS）附近富集了Pol II、H3K4me3和H3K27ac等蛋白，提示DC發育過程中表觀遺傳學變化與lnc-DC的轉錄增強事件相對應。進而作者通過序列分析發現在lnc-DC的轉錄起始位點附近（+44-+50）存在一個經典的PU.1結合位點。作者假設PU.1參與了lnc-DC的特異性表達。于是作者設計了如下實驗進行了進一步的驗證。

作者把lnc-DC的啟動子區段（-1447-+223）及其不同的突變體版本分別克隆到F-Luciferase表達框上游，然后和轉錄因子PU.1表達質?；蛘呖蛰d體（Vector）共同轉染到模式細胞系HEK-293T，通過測量熒光強度的變化間接反應轉錄活性的高低。最終證明轉錄因子PU.1通過經典結合位點（+44-+50）介導了lnc-DC在DC發育過程中的特異表達。

經典應用案例2

●　LncRNA通過吸附miRNA調控靶基因mRNA的表達 (ceRNA)

論文來源: Cesana, M., et al. (2011). "A long noncoding RNA controls muscle differentiation by functioning as a competing endogenous RNA." Cell 147(2): 358-369.

作者通過表達分析發現了一條肌肉發育相關的lncRNA---lnc-MD1.前期功能研究發現lnc-MD1可以調控肌肉分化的時間。信息學分析發現這條肌肉特異的lncRNA上包含36個miRNA的結合位點。如果只考慮肌肉發育相關的miRNA和基因，36個候選miRNA里面只剩下miR-133和miR-135。作者通過熒光素酶實驗進行了驗證。首先作者把野生型及其缺失miR-133和miR-135結合位點的Lnc-DC1克隆到進R-Luc的3’UTR，然后分別與表達miR-133和miR-135前體的質粒共同轉染到細胞進行熒光素酶活性檢測。證明lnc-MD1缺失存在miR-133和miR-135的結合位點。

進一步的信息學預測，miR-133和miR-135分別靶向兩個基因- MAML1 和 MEF2C。同樣，作者還是通過熒光素酶實驗進行驗證。研究者把MAML1 和 MEF2C的3’UTR （WT）和miRNA結合位點缺失突變體（-mut）分別克隆在RLuc表達框的下游，然后和miRNA過表達載體共轉染細胞進行酶活測定。結果顯示miR-133和miR-135確實分別靶向了MAML1 和 MEF2C兩個基因。最后的模型是lnc-MD1通過ceRNA機制吸附miR-133和135，正向調控了MAML1 和 MEF2C的表達，參與調控肌肉發育。